Od początku istnienia bydgoskiej książnicy funkcjonowała w niej czytelnia. W okresie międzywojennym biblioteka posiadała wypożyczalnię i dwie czytelnie: Pracownię Naukową i Czytelnię Pism. Dyrektor Biblioteki, Witold Bełza, dbał szczególnie o prawidłowe działanie czytelni, która miała służyć pracy naukowej. W kwietniu 1945 roku, po wojnie uruchomiono ponownie Pracownię Naukową oraz Czytelnię Pism. W 1951 roku po przebudowie i połączniu obu pomieszczeń utworzono Czytelnię Główną, z której mogło korzystać jednocześnie 40-60 osób. W latach 1982-1991 działała odrębna Czytelnia Czasopism, którą w czerwcu 1991 r. połączono z Czytelnią Główną. Od stycznia 2000 r, po przeprowadzce do wyremontowanych pomieszczeń przy Starym Rynku 24, obie czytelnie stanowiły znów odrębne jednostki. W 2001 r. rozpoczął działalność Ośrodek Informacji Gospodarczej i Prawnej, który został przekształcony w Czytelnię Ekonomiczno-Prawną.
Do najciekawszych zbiorów czytelni zaliczyć można:
- pierwszy jednojęzyczny Słownik języka polskiego autorstwa M. Samuela Bogumiła Linde, stanowiący największe i najbardziej kosztowne przedsięwzięcie wydawnicze w Księstwie Warszawskim, wydany w 1854 r. we Lwowie przez Zakład Narodowy Imienia Ossolińskich we wznowieniu poprawionym i poszerzonym przez Augusta Bielowskiego (Zdjęcie)
- wydawaną od 1951 r. najliczniejszą serię wydawniczą "Katalog Zabytków Sztuki w Polsce", na którą składa się 197 tomów (zdjęcie)
oraz
- piękne wydanie „Banderia Prutenorum” z 2009 r., upamiętniająca wydane w 1448 r. pierwsze dzieło historyczne Jana Długosza, charakteryzujące się złoconym blokiem i bogatymi ilustracjami 56 chorągwi krzyżackich zdobytych pod Grunwaldem, Koronowem i Nakłem (zdjęcie)
Obecnie czytelnie to nie tylko miejsce do pracy i nauki z książką papierową. Oferują także dostęp do polskich i zagranicznych baz danych z całego świata, e-booków i elektronicznych wydań czasopism.